吲哚菁綠 (ICG) 的熒光光譜測量及應(yīng)用
吲哚菁綠 (ICG) 作為熒光染料，常用于醫(yī)學(xué)熒光成像。這是因為生物組織光學(xué)窗口在650 nm - 1350 nm 內(nèi)穿透深度較大，并且在近紅外波段范圍內(nèi)效果明顯。ICG的主要吸收譜段在600nm-900nm之間，而所產(chǎn)生的熒光則在750-950nm之間，其特征峰約在810 nm波長處。
因此，ICG溶液在醫(yī)療領(lǐng)域中的獲得了廣泛的應(yīng)用。當(dāng)它的粉末溶解在無菌水后可以制備成高濃度注射液，常被應(yīng)用于例如肝功能研究（大型肝臟手術(shù)的術(shù)前測試）、眼科血管造影（檢查眼部的血管和其他結(jié)構(gòu)）和淋巴標(biāo)測（淋巴結(jié)、淋巴管和淋巴管體液）等。
1. 光譜儀 圖1：熒光測量實驗 AvaSpec-HERO 光譜儀 在本實驗中，我們使用的是 AvaSpec-HERO 光譜儀，它采用了高靈敏度緊湊型光學(xué)平臺和熱電制冷背照式CCD 探測器，其電路可以把噪聲信號抑制在很低水平，因此具有更好的信噪比以及動態(tài)范圍。不僅如此，AvaSpec-HERO還配備了USB3.0 高速通信接口以及千兆以太網(wǎng)通信接口，使其能夠方便快捷地與計算機通信。 由于AvaSpec-HERO的高靈敏度和信噪比，所以它非常適合熒光測量應(yīng)用。如圖1所示，我們使用785 nm激光器激發(fā)樣品，將反射探頭的一端連接到激光器，同時在反射探頭的接收端利用長通濾光片來過濾785 nm處的激發(fā)光，確保光譜儀只能檢測到熒光信號。 2. 實驗方法 實驗中，我們使用蒸餾水作為溶劑， 將μM轉(zhuǎn)換為mg/mL以獲得μM的對應(yīng)濃度。我們將2~50μM范圍均分成九組濃度，并在表中得到了以 mg/mL 為單位的理論濃度值（圖2）。圖3為ICG溶于蒸餾水的濃度。 圖2：μmol→mg/ml轉(zhuǎn)換表 圖3：ICG溶液濃度（溶劑：蒸餾水） 如圖4所示，每組實驗分別添加不同劑量的蒸餾水稀釋，以獲得濃度范圍在2 ~50μM的溶液。表中黃色高亮處、淺綠色高亮處、深綠色高亮處的實驗分別添加了濃度不同的ICG基礎(chǔ)溶液。最后，我們通過計算得到了真實濃度值，將其轉(zhuǎn)換回以μM為單位的數(shù)據(jù)。下方圖5所示的是不同濃度的 ICG 溶液樣品。 圖4：根據(jù)理論值計算所得的真實濃度和μM值 圖5：不同濃度的ICG溶液 為了避免室內(nèi)的環(huán)境光對測量產(chǎn)生干擾，我們在暗室中進行實驗。將反射探頭浸入到樣品中來采集光譜（每次測量之前用蒸餾水清洗反射探頭并擦干）。此時測量結(jié)果不再受到環(huán)境光的影響，可以更加準(zhǔn)確地進行 ICG 熒光測量。 3. 數(shù)據(jù)與結(jié)果 ICG 熒光測量的實驗結(jié)果 樣品1：0.0016 mg/mL ICG 熒光測量的實驗結(jié)果 樣品2：0.0063 mg/mL ICG 熒光測量的實驗結(jié)果 樣品3：0.011 mg/mL ICG 熒光測量的實驗結(jié)果 所有樣品匯總 向右滑動 分析與討論 測量結(jié)果顯示，ICG濃度越高，所產(chǎn)生的熒光越弱。如樣品1，濃度為0.0016 mg/mL，熒光峰值位于812.93 nm，峰值強度最大。樣品2的濃度為0.0063 mg/mL，熒光峰值為815.68 nm，峰值強度次之。實驗中ICG樣品的峰值范圍為812.93 ~ 823.94 nm，結(jié)果與文獻相吻合。 通常情況下，染料溶液濃度越高，它發(fā)出的熒光就越強，而ICG卻恰恰相反。這是因為ICG的激發(fā)光和產(chǎn)生的熒光波長相近，導(dǎo)致激發(fā)光與熒光會被同時檢測到。ICG的激發(fā)光通常在790 nm左右，激發(fā)光與熒光的光譜重疊會導(dǎo)致與濃度相關(guān)的熒光產(chǎn)生淬滅。淬滅是指任何降低熒光強度的過程。激發(fā)態(tài)反應(yīng)、能量轉(zhuǎn)移和分子碰撞都可能導(dǎo)致淬滅。ICG的分子距離非常近，可以對熒光光子產(chǎn)生自吸收效應(yīng)，并通過某種內(nèi)部轉(zhuǎn)換機制將這種能量轉(zhuǎn)化為振動(熱)。 4. 結(jié)論 ICG在醫(yī)學(xué)熒光成像領(lǐng)域中有著很好的應(yīng)用前景。尤其在近紅外范圍內(nèi)，可以穿透更深的活體組織。而且ICG 無毒、價格便宜，因此可以廣泛應(yīng)用在醫(yī)療領(lǐng)域中。但是，仍需對ICG進行進一步測試和實驗。它的許多特性，尤其是與熒光有關(guān)的特性，目前還是未知的。通過這個實驗，我們驗證了 ICG 熒光的一些關(guān)鍵因素： 1. ICG的濃度對于測量結(jié)果至關(guān)重要。 2. 使用時需要避免激發(fā)光的影響。在本實驗中，我們使用了 785 nm激光器和長通濾光片，以確保激發(fā)光不會過度干擾熒光從而產(chǎn)生淬滅。 3. 對于低濃度樣品，需要在暗室中進行測試，確保用反射探頭測量時不被環(huán)境光干擾。
